现有的实验和临床数据都明确支持靶向4-1BB 用于癌症免疫治疗的潜力。但4-1BB激动剂引起肝脏毒性阻碍了其进一步的临床开发，然而科研人员寻找具有强大抗肿瘤效果和低肝脏毒性的4-1BB抗体的脚步并从没有因此停止。在最新发表在Molecular Cancer Therapeutics期刊上题为“Epitope and Fc-mediated Crosslinking, but not High Affinity, Are Critical for Antitumor Activity of 4-1BB Agonist Antibody with Reduced Liver Toxicity”文章中，艾伯维公司的研究人员利用小鼠syngeneic肿瘤模型在体内进行筛选抗肿瘤效果强、肝毒性低的潜在临床4-1BB激动剂可能给我们一定的启发。他们的研究结果表明，结合表位和FcR相互作用对4-1BB mAb的抗肿瘤效果和降低肝脏毒性是重要的，而与其高亲和力可能无关。这里小编对他们的研究成果做一个详细的介绍。新型4-1BB mAb具有较强的抗肿瘤作用，且肝脏毒性较小首先研究人员用CT26 syngeneic小鼠模型鉴定了3种具有较好抗肿瘤效果的4-1BB mAb，分别命名为105,106,107。而 106和107不仅具有较强的抗肿瘤活性，且用药后小鼠体内的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平也很低，表明它们对肝脏的毒性较小。 图1. 新型4-1BB mAb的体内鉴定
竞争实验表明106和107相互竞争，但不与人或鼠4-1BBL竞争，揭示这两个mAb具有与配体结合位点不重叠的相似表位。106和107也不与其他已报道的抗鼠4-1BB (1D8、3H3和MAB9371)或抗人4-1BB Mab A竞争，表明它们与一个独特的表位结合。尽管106和107与阻断4-1BBL的抗人4-1BB Mab B有一定的竞争，但其结合表位并不完全相同。然后研究人员进一步研究了这个新型4-1BB mAb 106的抗肿瘤效果和肝毒性。以3H3作为对照4-1BB mAb，在CT26肿瘤模型上进行了剂量性研究。与3H3相比，106显示出与3H3相似的剂量依赖性抗肿瘤活性(图2A)，但106处理组的ALT水平较低，且和剂量无关 (图2B)。
图2. 新型4-1BB mAb具有较强的抗肿瘤作用，且肝脏毒性较小
此前已有研究表明，4-1BBmAb可以通过增加CD8+T细胞和巨噬细胞的浸润而导致肝损伤，因此人员对处理动物的肝组织研究其免疫细胞浸润水平。与106相比，3H3处理的小鼠肝脏显示出更多的白细胞浸润，包括CD8+T细胞和Iba1+巨噬细胞(图3)。
这些数据表明药物暴露量可能不是肝脏毒性差异的因素而且4-1BB激动剂在小鼠体内的抗肿瘤活性和肝毒性是可以分离开的。
图3. 肝脏的IHC结果
新型4-1BB mAb体内外的抗肿瘤活性依赖于Fc crosslinking研究人员评估了的4-1BB mAb的体内活性是否依赖于Fc，首先比较了107 IgG2a和107 IgG2aDANA(D265A-N297A，消除FcR结合的突变体)在CT26和MC-38肿瘤模型中抗肿瘤效力。如图4A和4B所示，107 IgG2a比IgG2aDana变异体具有更强的抗肿瘤活性，这表明FcR介导的活性对于体内抗肿瘤活性是重要的。在106 mAb中也观察到了类似的结果。然而有趣的是，107mIgG1亚型处理的小鼠比接受mIgG2a亚型治疗的小鼠产生了更多的无瘤小鼠(在CT26中，IgG1和IgG2a分别为5/8和0/8，在MC-38中分别为2/8和0/8)。由于小鼠IgG1和IgG2a都与FcRIIb和III接合，研究人员接着利用FcγR基因敲除小鼠评估了FcγR相互作用是否对4-1BBmAb的生物活性起关键作用。当CT26肿瘤在FCγRIIB-/-背景中生长和治疗时，IgG1和IgG2a亚型的107都完全失去了疗效(图4C), 在MC-38 WT中，107 IgG1和IgG2a之间的差异不显著(图4B)。在FcγRIII-/-小鼠中107 IgG1和IgG2a的抗肿瘤效果依然很好 (图4D)。这些结果表明，FcγRIIB在诱导小鼠体内抗肿瘤活性方面起着至关重要的作用。在一些文献中，另外两个4-1BBmAb已经在FcRIIB-/-小鼠身上进行了测试并且有效。clone 2A(rat IgG2a)在EL4E7淋巴瘤模型中被证明对FcRIIB-/-小鼠有效；Clone LOB12.0(mIgG1)在CT26肿瘤模型中显示出对FcRIIB-/-小鼠的抗肿瘤效果。据报道，LOB12.0的抗肿瘤活性主要依赖于肿瘤内Tregs的耗竭，这解释了FcRIIB介导的crosslinking对其体内疗效并不是必不可少的。由于Rat IgG2a与FcRIII结合，clone 2A可能也具有一定的Treg去除活性。然而，这些观察结果可能只是反映了所用模型中肿瘤微环境的不同和治疗开始时肿瘤大小的不同。有趣的是，在缺乏全部激活型的FcRs (Fcer1g-/-)但仍保留FcRIIB的小鼠中，clone 2A和LOB12.0在EL4E7和EG7模型中均获得了100%的长期存活率。这些结果表明，在某些情况下，激活FcRs干扰了FcRIIB介导的4-1BB的信号转导，并对体内抗肿瘤效应产生了负面影响。因此，通过Fc 工程化增强FcRIIB结合以及减弱与激活型FcRs作用的4-1BB mAb可能会产生最佳的抗肿瘤反应。
图4. 4-1BB mAb的抗肿瘤活性依赖于FcRIIB
然后为了研究106和107 mAb的内源性共刺激活性，以3H3为阳性对照，进行了小鼠CD8+T细胞共刺激实验。在没有Fc crosslinking的情况下，只有3H3具有显著的生物活性，表明106和107本质上不是很强的激动剂，但在以抗鼠IgG crosslinking作用的情况下，106和107诱导了GM-CSF细胞因子的释放(图5A)。同样，在人CD8+T细胞增殖实验中，Mab B、106-hIgG1AA(大鼠单抗与人IgG1Fc嵌合，具有L234A/L235A突变，降低FcγR结合)和107-hIgG1AA在与二抗crosslinking后诱导了T细胞增殖，但Mab A (IgG4或IgG1AA)即使在没有crosslinking的情况下也是有效的(图5B)。
这些数据表明，与Mab B相似，106和107mAb需要Fc crosslinking才能发挥T细胞共刺激因子的作用，而Mab A是一种强大的激动剂，能够自行诱导信号。为了排除IgG4亚型诱导crosslinking非依赖性活性的可能性，还将Mab A、Mab B、106和107的T细胞共刺激作用与IgG4进行了比较。只有Mab A在没有crosslinking的情况下表现出活性，表明其活性来自于其固有表位，而不是Fc亚型。为了进一步证实Fc介导的crosslinking作用，在CHO-K1上表达FcγIIB的情况下，在T细胞共刺激试验中比较了106和107 的不同IgG变体。人IgG4型单抗比IgG1型和IgG2型诱导更高的干扰素-γ分泌(图5C)。在缺少FcRIIB表达CHO-K1细胞的情况下，所有突变体均未观察到活性。这些数据表明，106和107需要Fc crosslinking才能诱导T细胞共刺激活性。这些结果与各亚型与FcRIIB的结合亲和力一致，IgG4比IgG1高约2倍，比IgG2高10倍。目前临床上的两种激动型4-1BB mAb的临床结果也符合此假设。Urelumab与Mab A一样是一种强大的4-1BB激动剂，而人IgG4亚型可能会增强其体内活性，这就解释了为什么它具有严重的肝毒性，必须以0.1 mg/kg或更低的剂量服用。Utomilumab是人IgG2，是FcRIIB crosslinking的最弱的亚型，这可能导致弱激动剂，这可以解释为什么utomilumab可以在10 mg/kg剂量下使用，没有任何肝脏毒性问题。此外，utomilumab可阻断4-1BBL，而urelumab则不能，这也可以解释活性差异。
图5. 106和107单抗的体外活性需要Fc交联
4-1BB mAb结合亲和力和体外活性可能与体内疗效和肝毒性无关虽然结合表位对其肝脏毒性起关键作用，但亲和力差异可能对4-1BB激动剂的活性起作用。为了研究4-1BB mAb的亲和力是否也会影响其肝毒性和功能活性，研究人员创建了两个具有不同4-1BB结合亲和力的106变异体：一个高亲和力突变体106H，其解离常数(Kd)为0.54 nM；一个低亲和力突变体106L，其Kd为220 nM。相比之下，亲本106 (106M)的Kd为17 nM。T细胞增殖实验显示，高亲和力106H诱导较强的T细胞活化，而低亲和力106L的生物活性非常有限，这表明亲和力与体外活性直接相关(图6B)。使用CT26肿瘤模型测试这些变异体的体内活性。有趣的是，在高浓度(3 mg/kg，图6C)下，106L的效力与亲本单抗和高亲和力单抗相当。令人惊讶的是，在低剂量(0.3 mg/kg)下，亲本106M和低亲和力106L对肿瘤生长的抑制作用好于高亲和力106H，而且没有引起ALT显著升高。所有这些单抗在3 mg/kg时血清ALT水平有轻微升高，不到对照组的2倍(图6D)。这些结果提示4-1BB mAb的亲和力可能在肝毒性中不起主要作用，低亲和力mAb在体内可能在低剂量下更有效。因此这些结果说明体外结合亲和力和生物活性并不能预测4-1BB mAb在小鼠体内的抗肿瘤功效。已知4-1BB可在多种免疫细胞中表达，包括肝脏中的髓样细胞，据报道，这些细胞在4-1BB激动剂介导的毒性中起作用。低亲和力激动剂有可能选择性地结合和激活4-1BB高表达的免疫细胞，如CD8+T细胞，而不结合肝脏中的低表达4-1BB髓样细胞，可能在一定程度了揭示了低亲和力抗体具有高抗肿瘤活性和低毒性的原因。
图6. 体外结合亲和力和活性不能预测体内疗效
本研究证明了表位和FcRIIB介导的crosslinking活性对于开发新型的4-1BB激动型单抗的重要性，这些新型的4-1BB激动型的具有较好的治疗效果以及低肝毒性，未来也许可以用于癌症免疫治疗。这项新的研究对于我们以后针对4-1BB 的ICB疗法的分子设计也具有重要的意义。
1. Sun K. Ho, et al., Epitope and Fc-mediated Crosslinking, but not High Affinity, Are Critical for Antitumor Activity of CD137 Agonist Antibody with Reduced Liver Toxicity, Molecular Cancer Therapeutics, 2020.
2. Sallin MA, et al., The anti-lymphoma activities of anti-CD137 monoclonal antibodies are enhanced in FcgammaRIII(-/-) mice. Cancer immunology, 2014.
3. Buchan SL, et al., Antibodies to Costimulatory Receptor 4-1BB Enhance Anti-tumor Immunity via T Regulatory Cell Depletion and Promotion of CD8 T Cell Effector Function. Immunity, 2018.
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