显微镜能DIY吗？能，一不小心还能获个诺贝尔奖
原文以 The microscope makers 为标题
发布在2017年11月28日的《自然》科技专题上
原文作者：Brian Owens
小部分科学家开始了显微镜DIY：如若没有合适的研究工具，就亲自动手造一个。
Wesley Legant在宾夕法尼亚大学读生物工程博士期间，遇到了一个令他沮丧的问题：尽管有想法，却没有能验证他想法的器材。
诸如IsoView层光显微镜等定制显微镜使研究者能够突破商用显微镜系统的局限。
来源：Raghav Chhetri and Philipp J. Keller
秉着对细胞力学和运动性的兴趣，Legant尝试开发能够测量细胞对其环境所施加作用力的工具。他将带荧光的珠子嵌入正在生长的哺乳动物细胞周围的材料中，这样一来细胞的运动会使材料变形，同时荧光珠子也随之运动。通过测量珠子的移动，Legand就能够计算出细胞施加的作用力。尽管如此，他仍难以获得准确数据。他表示：“这一工具是成功的，但是很快目前可用显微镜的局限显现出来了。”
细胞在其自身作用力下缓慢移动，最快的速度仅为每分钟几微米，因此显微镜需要长时间记录这一运动过程。为了追踪珠子的3D运动，Legant必须在高空间分辨率下对整个空间成像。在2010年前后可获得的商业显微镜——点扫描及转盘共聚焦显微镜，都不能胜任这项工作。
Legant表示：“其实这些显微镜的分辨率都足够追踪记录我们想观察的运动，但是其光毒性过强且速度太慢。”
如果是一个透明立方体，共聚焦显微镜使科学家能够逐个捕捉立方体中的每个点，并逐步形成3D图像。为了达成这一点，显微镜投射的光束垂直穿过样品，光线延伸穿过每个点。然而每次光线投射都会产生损伤样品的活性氧，这便是Legant所提到的光毒性效应。同时，显微镜所能检测的荧光基团的发射光随时间减弱，这一现象被称为光漂白。
在Legent的实验中，每个3D图像的获取需要约一分钟，之后他只能等五分钟再拍摄下一张照片，好让细胞利用这段时间恢复，避免在收集到理想数据之前细胞就被杀死。他能够用这种方法测量细胞施加的作用力，但却无法达到理想的精细程度。
为了解决这些问题， Legant在博士后研究中转移了研究重点。他与霍华德·休斯医学研究所珍妮莉娅·法姆研究学院（Janelia Research Campus）的物理学家及显微成像专家Eric Betzig合作，加入了正在逐渐壮大的显微镜DIY团体。
实时成像
制造显微镜是一项复杂且耗时的挑战，需要一个全能团队来处理所涉及的光学、机械及计算机方面的一系列问题。不过，潜在回报是巨大的，一种新的显微镜不仅能促进生物学发展，也促进显微镜学自身的进步。
在珍妮莉娅·法姆研究学院，研究者尝试突破神经科学和发育生物学的研究界限。这些领域高度依赖显微镜和成像技术，因此该机构有大量现成的商业显微镜。但当所需显微镜不存在时，他们不会等着别人来发明，而是自己在机构内部制造。
“我们进行技术研发工作的动力就是让利用现存显微镜不能进行的新型实验变成可能。”Philipp Keller表示。他是珍妮莉娅·法姆研究学院一名研究斑马鱼和果蝇神经系统发育的物理学家。
2005年左右，Keller在德国海德堡欧洲分子生物学实验室也遇到了与Legant类似的难题：他想在斑马鱼发育胚胎中追踪所有细胞以研究它们如何运动并聚集形成不同的组织和器官。但绝大多数已有的显微镜不能对直径700微米大小的细胞团样本进行成像，而长时间拍摄同样会因为高强度的光而导致细胞死亡。
研究者可以对不同构造采用定制设计，正如OpenSPIM.org所示。
来源：OpenSPIM/CC BY-SA 3.0
因此，Keller转向了当时刚开始投入使用的层光显微技术。层光显微镜并不照射整个样本，而是将弱聚焦、低强度的光层投射到用户想要拍摄物体的焦平面上。高质量的照相机能够在一次曝光中捕捉到完整的焦平面，通过沿着样品垂直移动该平面，研究者就可以重建完整的3D物体。
“层光显微成像是一种非常快速的技术，但同时也非常温和，”Keller说，“焦点外的结构不会暴露在光下受到可能的光损害。”那时没有现成的显微镜适用于Keller的研究，因此在2005年，他决定自己制造。他的设计被命名为数字扫描激光层照荧光显微镜（DLSM），能够在90秒内拍摄斑马鱼发育胚胎中的每一个细胞。
并非每个显微镜制造者在开始设计时头脑中都有特定的研究问题。对德国哥廷根马普生物物理化学研究所的物理学家Stefan Hell而言，提出显微技术新概念本身就是目标。“这就是一项科研项目，我做这些是为了推动显微成像技术发展。”
他获得了巨大的成功。2014年，Hell与斯坦福大学的William Moerner以及Betzig共同被授予诺贝尔化学奖，以表彰他们所发明的超分辨荧光显微镜，这项技术使研究者能够成像纳米尺度的生物结构 。
尽管Hell创造了多个显微镜设计并使其商业化，但他认为绝大多数生物学家并不需要效仿，因为制造商很快会将新想法转化为产品。他自己获得诺贝尔奖的设计——受激发射损耗显微镜（STED）——在1999年制造时花费了20万美元，而现在已经成为鞋盒一半大小的自动化系统并且能够附加到任何现有的共聚焦荧光显微镜上。他表示现在也已经有一些公司在生产层光显微镜。
但Keller同时也说层光显微技术领域目前仍处于初期，少数商业化系统仍比科学研究最前沿设计落后七到八年。“我们仍不得不制造自己的显微镜。”
自制显微镜有利也有弊。定制显微镜系统可能在速度和分辨率方面领先多年，并且可能更适用于某特定生物问题或系统，但这是以其灵活性为代价的。对某些DIY显微镜而言，即使是改变放大倍数这样的简单操作也可能很困难。此外，定制显微镜需要花大量时间和精力来组装和维护。
不过，来自美国国家心肺血液研究所的细胞生物学家Clare Waterman表示，对于那些愿意接受挑战的人而言，这样做是值得的。在上世纪90年代初，Waterman利用新拍照技术开发了荧光散斑显微技术，这项技术使得针对细胞骨架及其他大蛋白复合体的研究成为可能。她表示：“制造显微镜的好处就是你能得到别人得不到的答案，而坏处就是你必须自己解决遇到的所有问题，但那很有趣！”
DIY指南
无论是为了促进显微技术发展还是解决特定生物问题，制造新显微镜的过程都大致相同。Keller对此相当有经验，他表示“我们致力于制造新显微镜好几年了”，并对制造显微镜的过程进行了精炼总结（参见“DIY显微镜的十个步骤”）。Keller认为一个优秀的显微镜团队应该包括一位物理学家或生物医学工程师来管理项目运行，同时还需要至少四类专家提供支持：一位光学工程师来进行光学设计，一位机械工程师来将各部分组合成一个整体，一位软件开发人员来为机器设计程序，同时还需要一位计算机科学家将原始数据转化为可利用的图像。
显微镜DIY的十个步骤
制造显微镜的过程是复杂的，但物理学家Philipp Keller将其提炼为十步：
• 搜集设计灵感
• 光学设计方案及试验
• 利用计算机辅助设计软件设计显微镜主体及用户定制部分
• 订购相关部件，并制造定制机械元件及光学元件
• 测试各元件性能及整合的难易度
• 组装显微镜原型
• 编码显微镜控制软件
• 根据性能测试结果优化定制元件
• 进行验证试验
• 开发并优化图像处理软件
第一步是光学设计。光学工程师利用专业软件，如Keller和Legant所使用的OpticStudio（华盛顿州柯克兰Zemax公司产品），在虚拟空间完成光学设计，决定入射光、镜头、反射镜以及其他实现分辨率和相关所需特性的光学元件如何正确排列。
机械工程师随后将解决如何在现实世界中将这些部件组合在一起，如把物理元件与光学平台连接起来。“此时显微镜好像是一系列镜头排列成行，悬浮在空中，而将它真正变成实物的人是我。”与Keller合作的机械工程师Brian Coop说。
Coop表示此阶段的最大挑战是要严格遵守苛刻的物理条件限制。显微镜在聚焦于微米甚至纳米级的对象时，几乎没有误差的空间。镜头、反射镜和光源必须精确校准从而产生可用、清晰的图像，他需要考虑到一些微小的改变，如金属热膨胀可能会改变校准 。Coop指出：“重视光学校准的准确性能简化之后的所有步骤。”
Coop制造显微镜时会尽量使用现成的部件，或对重新利用之前显微镜的某一部件。但每个显微镜都会有一些定制部分，这就需要Coop在珍妮莉娅•法姆研究学院的机械车间内进行设计甚至生产。
以Keller最新的显微镜为例，其样品室能够容纳四个物镜浸入样品所在的介质中。显微镜必须被密封以防止漏液，但同时还要允许镜头独立移动。此外物镜排列紧密，相互之间仅有100微米间隙，且大小形状各不相同，因此Coop必须调整样品室和密封圈从而实现每一种可能的组合。他估计设计和制造每个样品室需要两到三天，花费800到1000美元。
当光学工程师和机械工程师组装好显微镜原型时，软件开发人员和计算机科学家便加入进来，确保各部件有序运行并且能够得到可用图像。许多显微镜制造者利用名为LabVIEW的商业软件包来控制显微镜，但随着机器越来越先进，有时还需要定制的方案，珍妮莉娅•法姆研究学院一名程序员Daniel Milkie表示。
他说：“我们在设计超越硬件极限的新工具、新类型显微镜，因此需要设计专门的软件来使其性能最大化。”关键在于要确保软件能够根据新需求（例如大量的检测器）快速灵活地进行调整。因此，Milkie使代码模块化，这意味着能够简单地整合新元素而不必从头重新开始。
但是软件方面最大的挑战是解决如何处理显微镜生成的大量数据。高速相机每秒能生成十亿字节数据，一些机器甚至同时运行多台相机。Milkie称仅Betzig实验室每年便可产生50-100万亿字节数据，他说：“产生了这么庞大的数据量，它们该何去何从？”
成品看起来与传统显微镜截然不同。所有部件（反射镜、镜头、光源、相机和样品室）通过许多杠杆和夹子固定到一个数吨重的平台上，避免显微镜受到振动。Legant将其比作一个复杂的乐高玩具。
Keller估计从头开始制造一个显微镜需要至少一年，如果团队能重复利用之前装置的部件和软件，则能少点时间。由于定制要求越来越高端，显微镜开发也变得越来越昂贵。2005年Keller制造DSLM显微镜花费了约5万美元，而其后显微镜的花费高达10到20万美元。他2015年最新制造的各向同性多视图显微镜耗费了一百万美元。Keller认为花5万美元制造一个显微镜并且能说它改进了现有工艺水平的时代已经一去不复返了。
定制显微镜的注意事项
定制显微镜需要更高的使用技巧，因为它常常需要针对每次实验做大量设置及校正，这种人为调整是商业显微镜生产厂家极力避免的。但Waterman认为这不应该成为一个障碍，因为相关原理在基础显微镜课程中都应该学到。
已发表的新型显微镜系统相关的研究常常会包含设计方案和部件清单。对于想获得更多指导的人，珍妮莉娅•法姆研究学院已将显微镜相关设计方案和软件制作成免费网络资源，并且提供关于显微镜制造过程的帮助。Legant表示网站上有约20小时的视频教程来演示如何组装调整所有部件，还包括其他专业知识资源。一些网站，如美国国立生物医学成像和生物工程学研究所光学成像项目的生物物理学家Hari Shroff建立的diSPIM.org，德国普朗克分子细胞生物及遗传研究所Pavel Tomancak发育生物实验室始建的OpenSPIM.org，以及西班牙巴塞罗纳光电子科学研究所Emilio Gualda所领导的OpenSpinMicroscopy，都免费提供各种光片显微镜配置方案。
尽管按照现有方案制造显微镜比从头开始设计简单，但仍需要相关光学、机械、电子、计算机编程及生物学知识。Gualda表示最大的优势是价格。OpenSpinMicroscopy提供的商用选择性平面光显微镜约为20万美元。而如果利用Gualda的开源软件以及如Arduino控制器等不昂贵的硬件，他估计研究者只需花费四分之一的价格就可以制造一台高质量的显微镜。“并且还能够根据需求进行自定义，”Gualda补充道。
另外还有用户可以获得建议并交换意见的在线论坛。2014年，哈佛医学院分子生物学家Srigokul Upadhyayula曾与Legant一起制造第一台晶格层光显微镜，他认为这种类型的合作代表了科学家工作方式的巨大改变。“过去每个研究者都是孤立的，这类团体很少见。”
对Legant而言，他正在准备在北卡罗莱纳大学成立自己的实验室。他将在这一职位上继续研究细胞生物学和显微镜设计。他的首批项目之一将是重新研究细胞如何运动。他说：“我们最新的系统解决了技术问题，但还未有机会来应用它解决实际问题。”如今既然已经创造出研究所需的工具，Legant或许终将得到他追寻多年的答案。ⓝ
Nature|doi: 10.1038/d41586-017-07528-7
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